本发明涉及一种分子生物技术领域，尤其涉及一种可用于快速鉴别鲽形目鳎科鱼类的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法。

　　鳎科(soleidae)作为鲽形目鱼类最丰富的类群，约有35属175种，很多种类都具有非常重要的经济价值，但是迄今关于鳎科鱼类核糖体序列的报道极其罕见，其中关于核糖体内转录间隔区2的研究更是空白。

　　核糖体内转录间隔区2（internaltranscribedspacer1，简称its2）是一段位于核糖体rna编码基因5.8srdna和28srdna中间的一段非编码区。5.8srdna和28srdna进化速率较慢，序列非常保守，而its2进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，因此可以作为区分不同物种以及进行系统进化分析的分子标记。

　　中国专利局于2017年9月29日公开了一种蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法的发明授权，授权公开号：cn104531688b，该发明采用提取蜘蛛基因组的总dna，通过线粒体基因组dna的长pcr(l-pcr)扩增和测序对蜘蛛进行鉴定，但其仅能对蜘蛛进行扩增；同样是采用dna技术对生物进行鉴定，但是其不能对明确的生物物种进行鉴定，且必须通过测序才能准确判定，并需要设计多对引物对基因组全序列进行扩增，耗时较长，过程繁琐。

　　为解决上述迄今关于鳎科鱼类核糖体序列的报道极其罕见，其中关于核糖体内转录间隔区2的研究更是空白的问题，本发明提供了一种通过设计鳎科鱼类its2的通用引物，能够一次性批量扩增多种头足类its2，不需要针对某个单独物种设计特异性引物，既节省了时间成本，又大大提高了工作效率，具有高效快捷特点的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法。

　　作为优选，所述鲽形目鳎科鱼类包括但不限于：蛾眉条鳎、缨鳞条鳎、带纹条鳎、日本条鳎、东方箬鳎、眼斑豹鳎、圆鳞鳎、褐斑栉鳞鳎、角鳎、卵鳎、塞内加尔鳎和卡氏大鼻鳎。

　　一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的设计方法，从genbank数据库中下载目前所有已经公布的鳎科鱼类5.8srdna和28srdna序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列用于设计扩增its2的通用引物。

　　一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法，所述鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物的扩增方法包括以下步骤：

　　（2）采用权利要求1中所述的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物；

　　（4）扩增引物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，测序及序列拼接。

　　作为优选，所述步骤（1）中为避免鲽形目鳎科鱼类肠道内容物污染，舍去其头颈部，只从其尾部提取dna。

　　所述pcr扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。

　　作为优选，所述待测的鲽形目鳎科鱼类包括但不限于：蛾眉条鳎、缨鳞条鳎、带纹条鳎、日本条鳎、东方箬鳎、眼斑豹鳎、圆鳞鳎、褐斑栉鳞鳎、角鳎、卵鳎、塞内加尔鳎和卡氏大鼻鳎。

　　（1）本发明所提供的一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物可以高效和特异地扩增弯鲽形目鳎科鱼类蛸的its2，并能够一次性对多个物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点；

　　（2）its2序列在鳎科鱼类不同物种中长度差异明显，可以通过凝胶电泳技术直接肉眼观察，可以高效快捷对形态相似或者形态损伤的物种进行鉴定。

　　图1为本发明所提供的鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物对鲽形目鳎科鱼类进行pcr扩增后的琼脂糖凝胶电泳图谱；

　　其中，m为marker，1为蛾眉条鳎，2为日本条鳎，3为带纹条鳎，4为缨鳞条鳎，5为圆鳞鳎，6为角鳎，7为褐斑栉鳞鳎，8为卡氏大鼻鳎，9为眼斑豹鳎，10为卵鳎，11为东方箬鳎，12为塞内加尔鳎。

　　下面结合本发明实施例和附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然所描述实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

　　实施例中所用鲽形目鳎科鱼类样品均采自野外自然环境中，所采标本均带回实验室进行信息登记，并均用体视显微镜鉴定，以确定种类。种类鉴定完成的鲽形目鳎科鱼类样品用100%浓度的纯酒精浸泡并保存于4℃的冰箱中备用。

　　采用dna抽提试剂盒法提取待测鲽形目鳎科鱼类样品的总基因组dna，为避免待测鲽形目鳎科鱼类样品的肠道内容物污染，舍去其头颈部，只从其尾部提取dna，dna提取直接采用dna提取试剂盒进行提取，所提取的鲽形目鳎科鱼类保存于-20℃条件下备用。

　　从genbank数据库中下载目前所有已经公布的鳎科鱼类5.8srdna和28srdna序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列用于设计扩增its2的通用引物。所合成的引物为：

　　所述pcr扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。

　　pcr产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳图谱如图1所示，its2序列在某些鳎科鱼类不同物种中长度差异非常明显，可以肉眼直接观察，高效快捷对形态相似或者形态损伤的物种进行鉴定。测序结果如下：

　　120一种鲽形目鳎科鱼类核糖体内转录间隔区2通用引物及设计和扩增方法

　　由包含在成核层的空腔中形成的晶种的基底生长并行伸长型元件（纳米丝、微丝）的方法与制造工艺

　　16S rRNA甲基化酶rmtB的LAMP检测引物、检测试剂盒及检测方法

　　Hla－结合肽，其前体，编码这些肽序列的dn段和重组载体的制作方法

　　用作聚(adp－核糖)聚合酶抑制剂的6－取代的2－喹啉酮和2－喹喔啉酮的制作方法

　　用作聚(adp－核糖)聚合酶抑制剂的7－苯基烷基取代的2－喹啉酮和2－喹喔啉酮的制作方法

　　污染成分琥珀腈降解微生物根瘤菌usda 110及其同属物种密码子库的制作方法